CCK-8試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA).已知濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測。先將生物素標(biāo)記的抗體同時(shí)溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時(shí)作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中的濃度呈比例關(guān)系。
CCK-8試劑盒的操作步驟：
1、配制瓊脂糖EB凝膠,電泳以分離DNA片段。任何類型或等級(jí)的瓊脂糖都可以使用。
我們強(qiáng)烈的推薦使用新鮮的TAE/TBE電泳緩沖液。不要重復(fù)使用電泳緩沖液，舊的電泳緩沖液PH會(huì)增加而降低DNA的回收產(chǎn)量;
2、電泳足夠時(shí)間后，在紫外燈下小心地把所需的DNA的片段切下來。并盡量去除多余的凝膠。
注意:DNA在紫外燈下的曝光的時(shí)間不要超過30秒，同時(shí)在紫外燈下操作的時(shí)候一定要戴保護(hù)眼鏡。
3、稱取空離心管的重量，切下帶目的片段的凝膠裝在1.5ml離心管中并稱其重量，求出凝膠塊的重量，近似地確定其體積。一般情況下，凝膠的密度為1g/ml，于是凝膠的體積與重量的關(guān)系可按下面換算:凝膠薄片的重量為0.2g則其體積為0.2ml;加入等倍凝膠體積的BindingBuffer，把混合物置于55℃~65℃水浴中溫浴7min至凝膠*融化，其間每隔2-3分鐘混勻一次;
重要提醒:在凝膠*溶解之后，注意凝膠-BindingBuffer混合物的pH值。如果其pH值大于8的話，DNA的產(chǎn)量將大大減少。觀察混合物的顏色，如果是橙色或紅色，則要加入5μl濃度為5M，pH為5.2的醋酸鈉，以調(diào)低其pH值。經(jīng)過這一調(diào)節(jié)，該混合物的顏色將恢復(fù)為正常的淺黃色。一般情況下，使用新鮮的電泳緩沖液，凝膠-Bindingbuffer混合物的PH值的不會(huì)升高;
4、轉(zhuǎn)移700μl的DNA-瓊脂糖溶液到一個(gè)HiBindTMDNA柱子，并把柱子裝在一個(gè)干凈的2ml收集管內(nèi)，室溫下，10,000×g離心1min，棄去液體。
一個(gè)HiBindDNA柱子最多可容納700μl的溶液，如果DNA-瓊脂糖混合物的體積大于700μl，可先轉(zhuǎn)移700μl溶液至柱子，離心完后，將余下的溶液繼續(xù)加上柱子上。但是每一個(gè)HiBindTM柱子最多可以結(jié)合25~30μgDNA。如果預(yù)期產(chǎn)量較大，則把樣品分別加到合適數(shù)目的柱中。
5、將柱子重新套回收集管中，加300μlBindingBuffer至HiBindDNA柱子中;室溫下，10,000×g離心1分鐘，去棄濾出液;這一步相當(dāng)關(guān)鍵，不要忽略此步。
6、將柱子重新套回收集管中，加入700μlSPWWashbuffer至HiBindDNA柱子中，室溫下，10,000×g離心1分鐘，去棄濾出液;注:SPWWashbuffer在使用前必須按瓶子標(biāo)鑒要求用無水乙醇進(jìn)行稀釋。
7、將柱子重新套回收集管中，重復(fù)加入700μlSPWWashbuffer至HiBindDNA柱子中，室溫下，10,000×g離心1分鐘，去棄濾出液;
8、棄去液體，將空柱子重新套回收集管中，10,000×g離心1min以甩干柱基質(zhì)殘余的液體。
這步可以去除柱子基質(zhì)上殘余的乙醇，不要省略此步―――對(duì)得到好的DNA產(chǎn)量是十分重要的。
9、把柱子裝在一個(gè)干凈的1.5ml離心管上，加入30~50μl洗脫液或滅菌水上柱子膜上，10,000×g離心1分鐘，離心管中的溶液就是純化的DNA產(chǎn)物，保存于-20度。
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