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克倫特羅快速檢測試劑盒說明書
一、原理
本試劑盒采用間接競爭 ELISA 方法，在微孔條上預(yù)包被偶聯(lián)抗原，樣本中的殘留物克倫特羅將和微孔條上預(yù)包被的偶聯(lián)抗原競爭抗克倫特羅抗體，加入酶標(biāo)記物后，用 TMB 底物顯色，樣本吸光值與其所含殘留物克倫特羅的含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出相應(yīng)殘留物克倫特羅的含量。
二、試劑盒特性
試劑盒靈敏度： 0.1ppb
孵育溫度： 25℃
孵育時間： 30min～15min
樣本檢測下限
尿 樣 0.1ppb
組 織（處理法一） 0.4ppb
組 織（處理法二） 0.1ppb
飼 料 1ppb
交叉反應(yīng)率
克倫特羅（Clenbuterol） 100%
特pu他林（Terbutalin） <1%
馬布特羅(Mabuterol) <1%
溴布特羅(Brombuterol) <1%
沙丁胺醇（Salbutamol ） <1%
萊克多巴胺（Ractopamine） <1%
樣本回收率
尿 樣 95%±22%
組 織 75%±20%
飼 料 80%±20%
三、試劑盒組成
1 微量測試孔 每條 8 孔，一板 12 條
標(biāo)準(zhǔn)液×6 瓶 0ppb 0.1ppb
2 0.3ppb 0.9ppb
（1ml/瓶）
2.7ppb 8.1ppb
3 酶標(biāo)記物 7ml 紅色帽
4 抗體工作液 10ml 藍(lán)色帽
5 底物 A 液 7ml 白色帽
6 底物 B 液 7ml 黑色帽
7 終止液 7ml 黃色帽
四、所用儀器、試劑
具備的儀器：酶標(biāo)儀、均質(zhì)器、振蕩器、離心機(jī)、刻度移液管、天平（感量 0.01g）、氮吹儀、恒溫箱、打印機(jī)
微量移液器：單道 20～200µl、單道 100～1000µl、多道 30～300 µl
試 劑：乙酸乙酯、乙腈、氫氧化鈉、濃鹽酸、
甲醇、無水硫酸鈉、正己烷
五、樣本前處理步驟
樣本處理前須知
（a）實驗中必須使用一次性吸頭，吸取不同試劑時要更換吸頭。
（b）實驗之前須檢查各種實驗器具是否干凈，必要時可對實驗器具進(jìn)行清潔，以避免污染干擾實驗結(jié)果。
樣本前處理需配制：
配液 1 0.1M HCl 溶液取 0.86ml 濃 HCl 加水定溶至 100ml。
配液 2 0.1M NaOH 溶液稱取 0.4g NaOH 加水定溶至 100ml。
配液 3 乙腈-0.1M HCl 溶液V 乙腈：VHCl =84：16。
樣本處理：
（a）尿樣本的處理方法
取 20µl 清亮尿樣直接測定（如果尿樣渾濁一定要過濾或 4000r/min 離心 10min，直至得到清亮尿樣），暫不使用的樣本應(yīng)冷凍保存。 3、 在 ELISA 分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于樣本稀釋倍數(shù): 1 倍 洗板的一致性，正確的洗板操作是 ELISA 測定
（b）組織樣本的處理方法一 程序中的要點。
1、稱 2±0.05g 均質(zhì)后的組織至 50ml 離心管中，加 4、 所有恒溫孵育過程，避免光線照射，用蓋板膜入 6ml 去離子水，充分振蕩 2min，室溫 蓋住微孔板。
4000r/min 以上離心 10min(注：若組織樣本中油 u 操作步驟：
脂含量較高，可在振蕩后放入 85℃水浴 10min 1、從 2～8℃冷藏環(huán)境中取出所需試劑，室溫（20～后再離心)； 25℃）平衡 30min 以上，注意每種液體試劑使
2、取 20µl 上層液進(jìn)行分析。 用前均須搖勻。
樣本稀釋倍數(shù): 4 倍 2、取出框架及需要數(shù)量的微孔，將不用的微孔放
（c）組織樣本的處理方法二 入自封袋，保存于 2～8℃。
1、稱取 2 ± 0.05g 均質(zhì)后的組織于 50ml 離心管 3、編號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每中，加入 6ml 乙腈-0.1MHCl，振蕩 2min,室溫 個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做 2 孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和
4000r/min 以上離心 10min； 樣本孔所在的位置。
2、取上清 3ml，加入 2ml 0.1M NaOH，加入 6ml 4、加標(biāo)準(zhǔn)品/樣本 20µl/孔到各自的微孔中，然后加乙酸乙酯，振蕩 1min，室溫 4000r/min 以上離 酶標(biāo)記物 50µl/孔，再加入 80µl/孔的抗體工作心 10min。取全部上清于 50～60℃氮氣流或空 液，用蓋板膜蓋板，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境氣流吹干； 反應(yīng) 30min。
3、加入 1ml 去離子水溶解干燥后的殘留物，混合 5、將孔內(nèi)液體甩干，用去離子水 250µl/孔洗板 4～30s； 5 次，每次間隔 15～30 秒，用吸水紙拍干（拍
4、取 20 µl 用于分析。 干后未清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
樣本稀釋倍數(shù)： 1 倍 6、顯色：加入底物 A 液 50µl/孔，再加入底物 B
（d）飼料處理方法 液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，25℃環(huán)境中避光顯
1、稱1.0±0.05g 研碎的飼料樣品于50ml 離心管中， 色 15min。
加入 10ml 甲醇，再加入 5g 無水硫酸鈉，充分 7、測定：加入終止液 50µl/孔，輕輕振蕩混勻，設(shè)振蕩 2min；15℃ 4000r/min 以上離心 10min； 定酶標(biāo)儀于 450nm 處（建議用雙波長 450/630n
2、吸出離心后的上清液 1ml，于 50～60℃氮氣流 m 檢測，5min 內(nèi)讀數(shù)），測定每孔 OD 值。或空氣流吹干，用 1 ml 去離子水溶解干燥后的 七、結(jié)果判定殘留物，再加入 1ml 正己烷混合 30s ；15℃ 結(jié)果判定有兩種方法，粗略判定可用第 1 種方4000r/min 以上離心 5min；去除上層有機(jī)相；
法，定量判定用第 2 種方法。注意樣本吸光度值與
3、取下層 20 µl 用于分析。
其所含克倫特羅量成負(fù)相關(guān)。
樣本稀釋倍數(shù)：10 1、粗略判定：
六、酶標(biāo)免疫分析程序: 用樣本的平均吸光度值與標(biāo)準(zhǔn)值比較即可得出
u 測定前應(yīng)須知： 其濃度范圍(ng/ml)。假設(shè)樣本 1 的吸光度值為 0.3，
1、 使用前將需用試劑和板條的溫度回升至室溫 樣本 2 的吸光度值為 1.0，標(biāo)準(zhǔn)液吸光度值分別是：（20～25℃）。 0ppb 為 2.243； 0.1ppb 為 1.816；0.3ppb 為 1.415；
2、 使用之后立即將所有試劑放回 2～8℃。 0.9ppb 為 0.74；2.7ppb 為 0.313；8.1ppb 為 0.155。則樣本 1 的濃度范圍是 2.7ppb～8.1ppb；樣本 2 的濃度范圍是 0.3ppb～0.9ppb，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中克倫特羅實際濃度。
2、定量分析
（1）百分吸光率的計算，標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)品或樣本的吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)（0 標(biāo)準(zhǔn)）的吸光度值，再乘以 100%，即B百分吸光率（%）＝ ×100%B0
（2）B—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值 B0—0ng/ml 標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值
（2）標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算以標(biāo)準(zhǔn)品百分吸光率為縱坐標(biāo)，以克倫特羅標(biāo)
準(zhǔn)品濃度（ng/ml）的半對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中克倫特羅實際濃度。
若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。
八、注意事項:
1、室溫低于 25℃或試劑及標(biāo)本未回到室溫（20～25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的 OD 值偏低。
2、在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會伴隨著標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作。
3、混合要均勻，否則會出現(xiàn)重復(fù)性不好的現(xiàn)象。
4、反應(yīng)終止液為 2M 硫酸，避免接觸皮膚。
5、不要使用過了有效日期的試劑盒；稀釋或攙雜使用會引起靈敏度、OD 值變化；不要交換使用不同批號的盒中試劑。
6、不用的微孔板放進(jìn)自封袋重新密封；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和無色的發(fā)色劑對光敏感，因此要避免直接暴露在光線下。
7、顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。標(biāo)準(zhǔn)品 1 的吸光度值小于 0.5 時，表示試劑可能變質(zhì)。
8、該試劑盒最jia反應(yīng)溫度為 25℃，溫度過高或過低將導(dǎo)致檢測吸光度值和靈敏度發(fā)生變化。
九、儲藏條件和保質(zhì)期
1、儲藏條件：試劑盒于 2-8℃保存，不要冷凍。
2、保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為 1 年，生產(chǎn)日期見包裝盒。
提示：酶標(biāo)板真空包裝袋若有漏氣，酶標(biāo)板仍然正常有效，不影響實驗結(jié)果，請放心使用。
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