實驗室經(jīng)驗之總結（四十五）：細胞培養(yǎng)常見問題解決！

1、如何儲存和解凍血清才不會使產(chǎn)品質量受損? 

建議血清應保存在-2O℃。若一次無法用完一瓶，無菌分裝血清至恰當?shù)臏缇萜鲀?，再放回冷凍。將血清從冷凍箱取出后，置?～8℃冰箱使之緩慢融解，一般是融解過夜。

 2、血清中包含絮狀沉淀，它們是什么，怎么處理? 

沉淀主要成分是纖維蛋白和脂蛋白，不會影響血清品質。 首先讓其沉淀在瓶子底部，中上層無沉淀血清直接轉出使用，下層血清裝到50ml無菌離心管，400g，離心3分鐘即可除去 (一般不建議采用過濾的方法除去沉 淀，因為沉淀會堵塞濾膜而無法過濾)。

3、實驗室如何選擇適合的血清? 

稀有的澳洲血清培養(yǎng)嬌貴細胞(小鼠ES、原代細胞分離培養(yǎng))，南美血清或國產(chǎn)胎牛血清用于癌細胞、常規(guī)細胞系培養(yǎng)(用量大)，新生牛血清用于病毒包裝(構建穩(wěn)轉細胞株)。

4、微生物培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素后，可長期保存嗎? 

一旦您在新鮮培養(yǎng)基中添加了血清和抗生素時，您應該在兩周內使用它。因為一些抗生素和血清中的基本成分在解凍后就開始降解。

 5、有必要做熱滅活嗎?

實驗顯示，經(jīng)過正確處理的熱滅活血清，對大多數(shù)的細胞而言是不需要的。經(jīng)此處理過的血清對細胞的生長只有微小的促進，或*沒有任何作用，甚至通常因為高溫處理影響了血清的質量，而造成細胞生長速率的降低。而經(jīng)過熱處理的血清，沉淀物的形成會顯著的增多，這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察，像是“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受污染，而把血清放在37℃環(huán)境中，又會使此沉淀物更增多，使研究者誤認為是微生物的分裂擴增。 若非必須，可以不需要做熱處理這一步。不但節(jié)省時間，更確保血清的質量!

6、細胞培養(yǎng)中出現(xiàn)黑點是污染嗎?如何處理? 

一旦您在細胞培養(yǎng)的過程中發(fā)現(xiàn)有黑點生成，首先，要肉眼觀察微生物培養(yǎng)基是否混濁，然后，在鏡下觀察培養(yǎng)細胞生長的狀態(tài)，黑點是否游動。如果細胞被污染，微生物則會大量繁殖，微生物培養(yǎng)基就會迅速變黃、變混濁。污染包括細菌污染、支原體污染等。 如果在鏡下觀察細胞，生長狀態(tài)良好，與黑點出現(xiàn)前相比，沒有任何變化，那么，黑點的出現(xiàn)可能與以下幾種情況有關

(1)細胞生長過老，破碎的細胞殘骸;

(2)血清質量不好，反復凍融的結果;

(3)配制培養(yǎng)基的pH值偏高，不宜細胞生長;

(4)培養(yǎng)原代細胞中出現(xiàn)小黑點，可能是原代組織中的雜質，多次傳代可以消除。

 7、EDTA在細胞消化過程中起什么作用?

EDTA是一種螯合劑，它可以螯合Ca2+ 或Mg2+，而細胞表面很多和培養(yǎng)皿或培養(yǎng)瓶結合的蛋白都是帶有Ca2+ 或Mg2+的，把這些離子螯合后，可以加速細胞和培養(yǎng)皿的脫離，促進消化。上皮類細胞的連接存在“橋粒”結構，是細胞間“牢固”的連接，但橋粒的形成依賴于鈣離子的存在。在胰酶消化細胞時，加入EDTA，可以破壞細胞的橋粒結構，使細胞能夠分散成單個細胞。通俗地說，就是破壞細胞間的粘連。

8、如何選用特殊細胞系培養(yǎng)基?

培養(yǎng)某一類型細胞沒有固定的培養(yǎng)條件。選DMEM做貼壁細胞培養(yǎng)、RPMI-1640做懸浮細胞培養(yǎng)。另外還可以參考ATCC的推薦信息。

9、 怎樣讓細胞適應新的條件?

從原條件逐漸過度：1/4、1/2、3/4，后是*新培養(yǎng)基。

10、為何微生物培養(yǎng)基保存于4℃，顏色會偏暗紅色?

（1）.培養(yǎng)基內之CO2會逐漸溢出，造成微生物培養(yǎng)基越來越偏堿性。顏色也會隨堿性增加而更偏暗紅。

（2）.培養(yǎng)基偏堿之結果，將造成細胞生長停滯或死亡。需調整pH值至7.0~7.2. 11、細胞凍存管應如何解凍? 37℃，1~2分鐘內全部融解。 冷凍管建議放在液氮液面上面，由液氮桶中取出解凍時，必須注意安全(戴護目鏡)，預防冷凍管之爆裂。

11、細胞凍存管應如何解凍? 可能原因：

(1)胰蛋白酶消化過度

(2)支原體污染

(3)消化液或培養(yǎng)液配制錯誤、過期儲存、儲存不當

(4)細胞老化(如傳代前細胞已匯合導致失去貼附性)

(5)接種細胞起始濃度太低或太高 解決辦法： 1． 準備一個培養(yǎng)容器，內裝合適體積的適宜培養(yǎng)基，并使其溫度和pH與建議的相稱 。 2． 在37℃或該細胞系正常生長溫度水浴下通過輕柔搖動迅速溶解凍存管（約2分鐘）； 3． 管中內容物溶解后立刻將凍存管移到超凈工作臺內，并用70%酒精消毒表面防止污染，注意無菌操作。 4． 擰開凍存管蓋，將管中內容物轉移到已裝有少量培養(yǎng)液的無菌離心管中稀釋，離心（一般125g，10分鐘），棄去上清并用1~2ml*培養(yǎng)基重新懸浮沉淀細胞，然后轉移細胞懸浮液到培養(yǎng)容器內混合均勻。注意：如果凍存液中含5% DMSO，則不必離心，只需用15ml培養(yǎng)液懸浮即可。因為DMSO在這個濃度時沒有毒性。 5．24小時后檢查培養(yǎng)情況，如果需要的話進行擴傳。有些細胞系（比如雜交瘤細胞）從凍存狀態(tài)恢復需要幾天時間。 實際上，一些雜交瘤細胞在天培養(yǎng)液中出現(xiàn)死亡細胞并產(chǎn)生許多細胞殘骸。許多細胞凍存后活力下降并在融化后24小時到一個低狀態(tài)。此后細胞將恢復并進入對數(shù)生長期。細胞復蘇過程不是很難，主要是速溶這步很關鍵。再有，細胞復蘇的狀態(tài)如何，較大程度上取決于細胞凍存時的操作。還有一點，細胞也是有思想的，你對他好，關心他照顧他，他也不會讓你失望的。

DC2.4小鼠樹突狀細胞    B-CPAP細胞培養(yǎng)說明書